胞内信号通路调控CAR T细胞功能的研究进展

陈焕鹏^1,2，黄朝峰^{2 #}

（1 广州医科大学附属第三医院生物样本库 广州 510150

2中山大学中山医学院人类病毒学研究所，广州 510080）

作者简介：陈焕鹏 男 博士后 地址：广州市荔湾区多宝路63号 电话：15902075442 邮箱：chhuanp@mail2.sysu.edu.cn

通讯作者：黄朝峰 男 副教授 博士生导师 地址：广州市中山二路74号10号楼N1311室，邮编：510080，电话：8620-87335529，传真：8620-87332588，邮箱：hzhaof@mail.sysu.edu.cn

摘要：嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）T细胞是肿瘤免疫治疗领域的新兴疗法，通过基因工程技术改造T细胞，使得CAR T细胞能够结合肿瘤细胞表面的特异性抗原，促使T细胞活化，发挥特异性抗肿瘤作用。嵌合抗原受体结构中的胞内信号区段激活决定了CAR T细胞的增殖分化能力，调控其细胞代谢特征和免疫持久性，进而影响CAR T细胞的临床疗效。本文从不同胞内共刺激信号通路对CAR T细胞的影响和在临床治疗中的差异，分析不同共刺激信号通路在CAR T细胞的受体设计和临床治疗策略选择方面的应用潜力，为CAR T细胞在肿瘤免疫治疗中的精准应用提供理论依据。

关键词：嵌合抗原受体T细胞；肿瘤；共刺激分子

Abstract: Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells is an emerging therapy in tumor immunotherapy. CAR T cells are modified through genetic engineering technology. CAR T cells can bind to the specific antigen on tumor cells to promote T cell full activation and exert anti-tumor activity. The activation of the CAR intracellular signal domain determines the proliferation and differentiation of CAR T cells and then affects the clinical efficacy of CAR T cells. This article will discuss the potential application value of each costimulator from the impact of different costimulatory intracellular signals on CAR T cells and provide a theoretical basis for the precise application of CAR T cells in tumor immunotherapy.

Keywords：CAR T, tumor, costimulator

T细胞活化需要两种信号同时传导，一个是通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）的抗原肽复合物结合介导的第一信号，决定了T细胞应答的特异性；第二个就是T细胞表面的共刺激信号，对于T细胞的完全活化是必要条件。共刺激信号激活可防止T细胞的失能，增强T细胞的活化。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）是一种人工T细胞受体¹，与TCR的激活方式不同，CAR能够不依赖于MHC分子的限制性直接识别肿瘤表面抗原，进而活化T细胞²。CAR的结构包括胞外抗原结合结构域的单链抗体（single Chain Fragment Variable，scFv）、间隔域、跨膜结构域和胞内信号传导域组成（图Ⅰ）。缺少了共刺激分子胞内信号的第一代CAR，胞内只含TCR信号中CD3ζ信号传导，致使T细胞无法完全活化，在治疗中没有取得很好的疗效³。而第二代CAR是在一代的基础上融合了共刺激分子的胞内信号与CD3ζ胞内信号^{4 5}，胞内共刺激信号的存在使得CAR T细胞得以被完全的活化，并激活CAR T细胞释放细胞因子，执行细胞毒性功能裂解肿瘤细胞，获得比较好的治疗效果⁶。共刺激分子主要包括CD28、ICOS、4-1BB、CD27和OX40^{7 8}，可增强T细胞增殖和分化，但不同共刺激分子胞内信号对CAR T细胞的活化作用并不完全相同。本文分别讨论不同共刺激分子调控T细胞的作用和融合不同共刺激分子胞内信号对CAR T细胞的影响，总结CAR结构设计对CAR T细胞抗肿瘤作用差异的最新研究进展，为CAR T细胞在肿瘤免疫治疗中的精准应用提供理论依据。

图Ⅰ：TCR与CAR的结构

CD28 CAR

CD28是T淋巴细胞表面主要的共刺激分子，CD28对T细胞活化过程中起关键作用⁹。CD28的受体为抗原提呈细胞表面的CD80和CD86。CD28的激活会放大TCR信号周期，激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶AKT通路，从而激活T细胞的增殖、分化以及效应因子产生¹⁰。CD28胞内信号激活YMNM基序内的天冬酰胺募集生长因子受体结合蛋白2（GRB2），并激活NF-AT的活性，诱导T细胞产生更多的IL-2¹¹。CD28的激活还上调了葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达¹²，从而增强T细胞的糖酵解途径¹³。同时，CD28激活还调控了T细胞的线粒体功能¹⁴。CD28通过mTOR信号通路调节T细胞的各种代谢途径，包括脂质和糖类的分解代谢¹⁵。

CD28作为T细胞激活的最主要的共刺激分子，将CD28胞内结构域融合到CAR中，可以显著的激活CAR T细胞，诱导CAR T细胞的信号转导。CD28胞内信号激活CAR T细胞的糖酵解功能，会诱导产生效应记忆CD8⁺ T细胞¹³。最新研究发现，将CAR 结构中CD28胞内信号YMNM基序单个氨基酸残基突变可以促进CAR T细胞的存活和抗肿瘤活性¹⁶。融合CD28胞内信号的CAR T细胞表现出迅速的增殖和杀伤肿瘤细胞。但临床结果发现，相比于4-1BB胞内信号的作用，以共刺激分子CD28胞内信号激活的CD19-CAR T细胞在回输治疗后容易引起患者发生脑水肿死亡¹⁷，但这是否与CD28胞内信号对CAR T细胞的过度激活有关还需进一步研究证实。

ICOS CAR

诱导型共刺激物（ICOS）也属于CD28超家族成员，是在激活的T细胞上高度表达的共刺激分子¹⁸。在TCR和CD28共同刺激后，ICOS被迅速诱导表达¹⁹。ICOS和CD28都是CD28家族的成员，可协同调节T细胞分化，功能上具有相似性。ICOS也是通过激活PI3K-AKT信号通路，诱导T细胞的增殖和效应因子的表达²⁰。但ICOS与CD28主要调控的细胞种类有差异。ICOS主要参与调控CD4⁺ T细胞中T滤泡 辅助细胞（Tfh）和T辅助细胞17（Th17）的细胞分化和扩增²¹。同时，激活ICOS也被证明可以增强CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤活性²²。ICOS与CD28的不同还在于ICOS的胞内信号区段无法募集GRB2，因此不能诱导T细胞产生IL-2²³。与CD28一样，ICOS可通过mTOR激活促进T细胞的葡萄糖摄取，调节T细胞的代谢功能²⁴。

融合共刺激分子ICOS胞内信号的CAR T细胞具有更高的PI3K激活和IFN-γ产生，并且ICOS胞内信号增强CAR T细胞的免疫持久性²⁵。ICOS胞内信号激活促进CD4⁺ CAR T细胞上调表达白介素-17（IL-17）²⁶。ICOS胞内信号传导也诱导CAR T细胞核转录因子T-bet的活性，而T-bet调控了CD4⁺ T细胞向T辅助细胞1（Th1）细胞的分化。ICOS胞内信号的激活会诱导CAR T细胞向Th17 / Th1细胞分化，而Th17 CAR T会介导高效且持久的抗肿瘤反应²⁶，说明CAR结构中融合ICOS胞内信号主要作用于CD4⁺ T细胞。CAR的共刺激区段同时包含ICOS胞内信号与4-1BB胞内信号时，可同时增加CD4⁺ CAR T和CD8⁺ CAR T细胞抗肿瘤的持久性，包含ICOS胞内信号可显著增强CAR T细胞的功能²⁵。尽管在二代CAR研究中，ICOS构建的CAR T细胞的体内抗肿瘤效果没有优于CD28和4-1BB的CAR。但ICOS调控了CD4⁺ CAR T细胞的分化和存活，这有助于CD4⁺ CAR T细胞在肿瘤治疗中发挥更大作用。

4-1BB CAR

共刺激分子4-1BB是肿瘤坏死因子受体超家族的成员（TNFRSF），与配体结合的4-1BB募集肿瘤坏死因子受体关联因子（TRAF）到4-1BB的胞内结构域形成复合物，通过级联放大作用上调核转录因子NF-κB和JNK通路的活性²⁷，最终促进4-1BB介导的T细胞增殖、存活和T细胞效应因子的表达²⁸。4-1BB还能够诱导细胞端粒酶活性，激活T细胞的活化²⁹。4-1BB通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC1α）介导的脂质代谢途径，增强T细胞线粒体的功能，维持记忆T细胞的功能³⁰。

4-1BB与CD28是目前CAR胞内结构域中应用最多的共刺激分子，通过小鼠实验发现包含4-1BB胞内信号的CAR T细胞比包含CD28胞内信号的CAR T细胞表达更高的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X_L，4-1BB胞内信号有助于增强CAR T细胞的增殖、存活和细胞因子分泌³¹。4-1BB胞内信号传导还能维持CAR T细胞长效抗肿瘤作用³²。研究表明，通过反复抗原刺激CAR T细胞，4-1BB胞内信号可以改善CAR T细胞的耗竭水平^{13 33}，并增加CD8⁺ 中央记忆T（T_CM）细胞的比例，具有中央记忆表型的4-1BB CAR T细胞通过持续分泌IFN-γ来增强抗肿瘤活性³⁴。研究发现4-1BB胞内信号增强CAR T的功能需要依赖于NF-κB和TRAF的调控³⁵，4-1BB胞内信号还促进CAR T细胞的脂肪酸氧化，增强线粒体的氧化呼吸能力³⁶。临床研究表明，4-1BB胞内信号能够维持CAR T细胞在血液肿瘤患者体内的长效抗肿瘤功能，同时引起更少的神经毒性和细胞因子风暴¹⁷。目前的研究表明，4-1BB的胞内信号主要作用于CD8⁺ CAR T细胞，维持CAR T细胞抗肿瘤功能，其对CD4⁺ CAR T细胞的作用有待进一步的研究。

CD27 CAR

CD27也是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，在NK细胞、B细胞以及T细胞上表达^37-39。CD27在静止和记忆T细胞中有表达，并在T细胞激活后被上调表达。CD27激活会促进T细胞的增殖和存活^{31 40}，维持记忆T细胞的发育⁴¹。CD27刺激既可以诱导效应细胞的扩增和存活，又可以增强记忆细胞的发育，维持T细胞长期的免疫功能⁴²。CD27激活上调T细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-X_L，抵抗Fas和Fas配体（Fas-L）介导的效应细胞凋亡的影响⁴³，从而促进T细胞存活和记忆细胞的形成⁴⁴。CD27信号激活可增强周围组织中的T细胞功能⁴⁵。CD27激活T细胞上调表达IL-2、IFN-γ等效应因子⁴⁶。与共刺激分子4-1BB一样，CD27刺激会驱动TRAF介导的JNK激活和NF-κB信号通路²⁷。CD27信号还能诱导CD4⁺ T细胞的分化为Th1细胞，Th1细胞能够抑制肿瘤的生长⁴²。CD27激活通过诱导T细胞上调表达趋化因子CXCL10，促进T细胞的趋化作用和DC细胞的募集⁴⁷。

尽管共刺激分子CD27对CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化起到重要作用，但尚不清楚CD27胞内信号传导对CAR T细胞功能的影响。只有Song等报道，融合了CD27胞内信号区段的CAR，在抗原刺激后能够诱导CAR T细胞Bcl-X_L蛋白的表达增加，提高了CAR T细胞的抗凋亡能力，增加了T细胞在体外的扩增^{48 49}。虽然CD27信号激活能上调T细胞的IL-7受体（IL-7R）的表达，也有文献报道通过激活IL-7和IL-7R的信号通路能够显著增强CAR T细胞的抗肿瘤疗效⁵⁰。但共刺激分子CD27胞内信号对CAR T细胞的抗肿瘤作用尚不清楚，关于融合CD27胞内信号构建的CAR的研究还非常少，CD27胞内信号是否能够有助于CAR T细胞在实体瘤中的应用还有待深入研究。

OX40 CAR

共刺激分子OX40与CD27和4-1BB一样，也是TNFRSF的成员。OX40在活化的T细胞上表达。OX40参与调控T细胞的活化、增殖、分化以及效应因子的表达。研究表明OX40诱导T细胞增殖与4-1BB相似，也是通过TRAF的募集作用。OX40的激活介导TRAF2的活化，诱导NF-κB信号通路途径⁵¹，促进了PI3K-AKT途径提高细胞存活和细胞周期，从而诱导抗凋亡基因表达⁵²。激活OX40可以增加肿瘤浸润调节性T细胞（Treg）的糖酵解和脂肪酸合成相关基因⁵³。研究发现，OX40优先在活化的CD4⁺ T上表达⁵⁴，缺乏OX40的CD4⁺ T细胞被激活后无法保持抗凋亡蛋白Bcl-2的高水平表达⁵⁵，表明OX40对CD4⁺ T细胞上的作用十分重要。OX40还参与调控CD4⁺ T细胞的分化为Th1和Th2细胞。与4-1BB 主要作用于CD8⁺ 记忆T细胞不同，OX40主要作用于CD4⁺ 记忆T细胞的产生⁵⁶。

目前，共刺激分子OX40胞内信号更多的是应用在第三代CAR结构中⁵⁷。体外实验研究发现，OX40胞内信号对CAR T细胞的作用类似于4-1BB胞内信号⁵⁸。融合OX40胞内信号的三代CAR发现，OX40胞内信号可以促进CAR T细胞产生更多的IFN-γ和IL-17等促炎因子⁵⁹。联合CD28与OX40胞内信号可增强CAR T细胞抵抗激活诱导的细胞死亡，维持效应细胞的持续抗肿瘤活性⁶⁰。具有OX40胞内信号的第三代CAR可抑制CAR T细胞因CD28胞内信号诱导的IL-10分泌，但不影响炎性因子分泌和CAR T细胞增殖⁶¹。最新研究发现，CAR结构中共表达全长OX40共刺激分子，能够增强了CAR T细胞的增殖并减少T细胞凋亡，维持CAR T细胞毒性，并且降低了耗竭分子的表达，从而增强了CAR T细胞在实体瘤的免疫抑制性肿瘤微环境中的抗肿瘤作用⁶²。OX40胞内信号主要作用于CD4⁺ CAR T细胞，增强 CAR T细胞的存活⁶³，但OX40胞内信号调控CAR T细胞的具体机制还有待进一步的研究。

总结

CAR的激活是通过胞外抗原识别区段scFv与肿瘤细胞表面抗原的直接结合，进而激活T细胞。CAR活化T细胞的信号强度取决于scFv的亲和力以及CAR分子与靶抗原之间的空间距离。CAR的激活缺乏CD4和CD8与MHC的相互作用的增强信号，所以CAR信号的传导不能完美的模拟TCR信号，致使CAR引起的胞内磷酸化水平与TCR引起的信号强度并不完全相同。共刺激信号可以降低TCR的阈值，促进T细胞的完整活化，而CAR结构中包含的不同共刺激分子胞内信号对CAR信号的传导作用强度也不相同，深入了解不同共刺激分子对CAR T细胞的作用，有助于精准发挥CAR T细胞在不同肿瘤的治疗作用。

CD28和ICOS为CD28超家族成员，促进T细胞的快速增殖，其胞内信号主要介导CAR T细胞的效应功能，其中CD28和ICOS促进有氧糖酵解，并且CD28胞内信号快速诱导CAR T的增殖，对需要大剂量的CAR T细胞的实体瘤治疗或许有益。而TNFR超家族的成员4-1BB、CD27、OX40主要参与记忆T细胞的调控，4-1BB胞内信号主要介导CAR T细胞的脂质代谢和线粒体功能，诱导抗凋亡分子的表达。不同共刺激分子调控不同亚群的T细胞：ICOS主要作用于CD4⁺ T细胞，诱导Th17细胞分化；4-1BB主要作用于CD8⁺ T细胞；OX40主要作用于CD4⁺ T细胞，诱导Th1细胞分化；而CD27可能同样参与了初始CD4⁺和CD8⁺ T细胞的应答及扩增阶段。不同共刺激分子胞内信号作用CAR T细胞调控细胞因子的表达也不相同：CD28胞内信号诱导CAR T细胞表达更高的IL-2；而ICOS胞内信号诱导CAR T细胞表达IL-17等炎性细胞因子；OX40胞内信号能够抑制CAR T细胞抗炎因子IL-10的表达；CD27虽然没有发现其诱导CAR T细胞的细胞因子表达，但CD27可以诱导T细胞IL-7R的重新表达，促进T细胞对IL-7的反应性。不同的淋巴细胞亚群、细胞分化水平、代谢途径、以及不同细胞因子的表达均对CAR T细胞的抗肿瘤免疫起到不同的作用。针对血液肿瘤，CAR T细胞能充分接触肿瘤细胞，CAR T细胞在体内的持久性就显得尤为重要。其中，4-1BB激活增强CD8⁺ CAR T细胞的抗凋亡和维持记忆T细胞功能，是血液瘤治疗中CAR结构胞内共刺激分子很好的选择。对于实体瘤抑制性的免疫微环境，基于肿瘤的异质性和免疫微环境差异，需要探讨选择CAR结构中何种胞内共刺激信号，才能满足CAR T细胞长期存活；维持CAR T细胞的强效的抗肿瘤作用；同时对CD4⁺ 与CD8⁺ T细胞都有作用，帮助CAR T细胞突破实体瘤免疫治疗的瓶颈，实现CAR T细胞在肿瘤治疗中的精准应用。

综上所述，通过研究不同共刺激分子对T细胞的调控作用及其胞内信号增强CAR T细胞的机制，有助于在不同肿瘤免疫微环境背景下，CAR T细胞治疗的策略选择。明确适用不同免疫抑制条件下的CAR受体设计和精准应用，进而充分发挥CAR T细胞在肿瘤治疗中的作用潜力，为实现其最大的临床应用价值奠定理论和实验基础。

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